太子参药材的快速分子鉴定

发布时间:2019-08-28 来源: 历史回眸 点击:

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  [摘要]为建立一种简便快捷的太子参分子鉴定方法,对太子参药材及其混伪品的rDNA-ITS片段进行比对分析,找出特异性片段,设计太子参鉴别引物,并优选扩增条件,扩增产物经100×SYBR Green I染色后紫外光下观察。结果显示,PCR扩增反应液(包括DNA Taq聚合酶预混液5.5 μL,Tzs-2F,Tzs-2R各10 pmol,DNA模板20~80 ng,双重灭菌蒸馏水加至25 μL)经95 ℃预变性1 min,95 ℃变性5 s,56 ℃退火延伸15 s,30个循环,72 ℃后延伸30 s后,在扩增产物中加入1 μL 100×SYBR Green I混匀后于紫外光下呈绿色荧光的为太子参,混伪品无绿色荧光出现。40 min内即可完成DNA提取、扩增等整个鉴定过程。该方法能特异性扩增太子参DNA,紫外光下肉眼观察即可鉴定药材的真伪,且操作简捷、结果准确、利于推广,可为快速鉴定中药材的真伪提供参考。
  [关键词]太子参;分子鉴定;特异性PCR;SYBR Green I
  太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostella riaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm的干燥块根,具有益气健脾、生津润肺的功效,用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、肺燥干咳等症的治疗[1]。作为药食两用品种,太子参近年来得到了广泛的开发与利用。为牟取私利,市场上出现以淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.、繁缕Stellaria media (L.) Cirillo、宝铎草Disporum sessile D. Don、直立百部Stemona sessilifolia (Miq.) Miq.、阔叶山麦冬Liriope platyphylla F. T. Wang & Tang、矮小山麦冬L. minor (Maxim.) Makino等植物的根或块根冒充太子参销售[2-5]。其外形与太子参较为相似,特别是加工粉碎后,药材饮片特征消失、细胞差异不明显、理化反应繁锁等等。针对这种传统鉴定方法难以准确判定的易混药材,建立一种操作简捷、结果准确可靠的新型鉴定方法具有现实价值和实践意义。
  DNA分子鉴定方法是根据基因组序列进行比较研究,在很大程度上弥补和克服了传统鉴定的缺陷和难题。其中的特异性PCR是根据正品、伪品药材特定区域的DNA序列,设计有高度特异性的正品鉴别引物,此引物能有效扩增来自正品药材DNA模板中的特定区域。鉴定样品时,用鉴别引物对所提取样品的DNA进行PCR扩增,经凝胶电泳检测鉴别样品真伪[6]。但电泳过程繁琐、耗时,所用溴化乙锭(EB)试剂污染环境和危害人体健康[7]。探讨一种更安全、更灵敏的分子标记检测方法将有助于特异性PCR鉴定技术的推广及大规模样品的鉴定。
  本文针对太子参及其常见混伪品(淡竹叶、繁缕、宝铎草、禾叶山麦冬、阔叶山麦冬、矮小山麦冬、直立百部、蔓生百部、对叶百部)的物种DNA,采用特异性PCR鉴定技术对DNA进行特异性片段扩增,然后在扩增产物中加入DNA核酸荧光染料SYBR Green I,紫外光下观察荧光反应的有无,从而判断太子参药材的真伪。这是一种不需要凝胶电泳操作,即可准确鉴定太子参药材的快速分子鉴定方法。
  1 材料
  实验材料太子参药材购于贵州施秉、安徽宣城、江苏句容、福建柘荣、山东临沂等地,共37份样本,每份样本500~1 000 g,按产地混合后四分法取100 g打粉。另收集到太子参伪品共41份,分别为宝铎草、繁缕、直立百部、蔓生百部、对叶百部、阔叶山麦冬、禾叶山麦冬、矮小山麦冬、淡竹叶,均为块根,每份样本100~200 g,按产地混合后四分法取100 g打粉。实验材料样本数及产地见表1。样品经贵阳中医学院生药教研室江维克教授鉴定。
  琼脂糖(西班牙Biowestagarose);D2 000,10 000× SYBR Green I核酸染料(北京索莱宝科技有限公司);2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技术有限公司);EB,2×Taq PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司);Premix Ex TaqTM Version 2.0(宝生物工程大连有限公司);其他试剂均为分析纯。
  PCR仪(Mastercycler,德国Eppendof);核酸定量分析仪(NANODROP 2000,美国Thermo);凝胶成像系统(GGM/D2,英国SYNGENE);电脑三恒多用电泳仪(DYY-12,北京六一仪器厂);自动蒸汽灭菌锅(ES-315,日本Tomy);低温高速冷冻离心机(Centrifuge 5810R,德国Eppendof);三用紫外仪(ZF-2,上海市安亭电子仪器厂)。
  2 方法
  2.1 基因组DNA的提取及检测 采用碱裂解法提取各药材样品基因组DNA[8-9],核酸定量分析仪检测DNA的浓度及纯度。用通用引物ITS2F/ITS3R[10]扩增样品DNA以验证模板DNA的质量。引物序列及PCR扩增方法见表2。DNA样品保存于-20 ℃冰箱。
  2.2 PCR引物设计与特异性筛选 在NCBI(National Center for Biotechnology Information,美国国立生物技术信息中心)下载到太子参及其伪品物种的rDNA-ITS序列,ClustalX2.1软件进行排序、比对、分析,找出具有稳定差异的特异性片段。运用Premier Primer 5.0软件针对太子参的特异性片段设计了3对鉴别引物,分别命名为Tzs-1F/Tzs-1R,Tzs-2F/Tzs-2R,Tzs-3F/Tzs-3R,序列见表2。各引物由上海生工生物科技有限公司合成。

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